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溫和、高效的人iPSCs的單細胞克隆技術(shù)

更新時間:2024-03-28      點擊次數(shù):1037
  新開發(fā)的療法,如干細胞療法,正在將醫(yī)學(xué)領(lǐng)域從治療癥狀轉(zhuǎn)變?yōu)橹斡膊 H祟愓T導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)以其分化為不同細胞類型和組織的能力改變了再生醫(yī)學(xué)。雖然人類iPSCs已經(jīng)用于自體治療,但下一個突破將是開發(fā)經(jīng)認證的iPSCs用于現(xiàn)成的治療。為了實現(xiàn)這一目標(biāo),可以通過人類白細胞抗原(HLA)消耗來降低異種iPSCs的免疫原性,從而建立GMP級的主細胞庫,用于細胞的大規(guī)模生產(chǎn),同時降低同種異體療法的制造成本[1]。
 
  開發(fā)基因工程的iPSCs需要在轉(zhuǎn)染后進行幾輪克隆篩選,傳統(tǒng)的有限稀釋法分離單細胞耗時長,熒光標(biāo)記分選影響高度敏感的iPSCs的存活率,并且有污染的風(fēng)險。相比之下,CYTENA的克隆篩選單細胞打印系統(tǒng)利用透明微流控芯片和實時成像技術(shù)、算法,以高活力和高效率將單細胞分選和分配到96/384孔板內(nèi)。
 
  近年來,利用此設(shè)備分離iPSCs的方法已被報道[2-4]。在這里,展示了使用UP.SIGHT在不損失多能性的情況下,對人類iPSCs溫和分離單細胞克隆在技術(shù)上是可行的,在方法優(yōu)化后的單克隆回收率高達80%。
 
  材料與方法  
 
  來源于人成纖維細胞的對照iPSCs在無滋養(yǎng)層細胞的6孔板中,用TeSR E8培養(yǎng)基培養(yǎng)[5]。細胞匯合度到70%的時候,按1:3 ~ 1:6比例稀釋傳代。用于單細胞分選的細胞也在60- 70%的匯合度下進行收獲,確保細胞看起來健康且未分化的狀態(tài),并以0.5-0.8x10 6個細胞/ mL的濃度在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重懸為單細胞懸液。將80 uL的單細胞懸液裝入芯片(EASY.ON cartridge)并安裝在UP.SIGHT上進行單細胞分選。單細胞重懸液和孔板中的克隆培養(yǎng)基中都含有ROCK抑制劑,單細胞分選于裝有克隆培養(yǎng)基的96孔板上,分選完的板子盡快轉(zhuǎn)回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在前7天用UP.SIGHT監(jiān)測iPSCs的單克隆生長。
 
  結(jié)果與討論  
 
  對照組采用手動有限制稀釋法,濃度為0.5個細胞/孔進行鋪板 [6-7],10天后達到了預(yù)期的10-20%的克隆率(數(shù)據(jù)未顯示)。使用UP.SIGHT進行的第一次分選實驗在相同的條件下獲得了6%的克隆率(圖1 A)。以這些實驗設(shè)計為基準(zhǔn),通過系統(tǒng)的逐步優(yōu)化條件來逐漸提高回收率。
 
  首先,我們優(yōu)化了裝載在UP.SIGHT墨盒上的細胞重懸液。確定與使用原始基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比,使用鹽水緩沖液后近乎使克隆恢復(fù)提高一倍(圖1 B)。其次,由于iPSCs通常需要定期更換培養(yǎng)基,這種在早期更換培養(yǎng)基的操作對脆弱敏感的iPSCs的生長是有不利的,我們測試了在分選后的前7天中通過添加補充制劑到培養(yǎng)基中來避免更換培養(yǎng)基組份的效果。用補充制劑A(圖1 C)和不同濃度的補充制劑B(圖1 D和E)添加到克隆培養(yǎng)基,均可以獲得更高的單克隆率,其中補充制劑B可提高到50%。

圖1:優(yōu)化分選提高克隆回收率

 
  A:初始重懸細胞液條件,與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件最相似。B:鹽溶液作為重懸液。C:添加了補充制劑A的克隆培養(yǎng)基. D-E:添了不同濃度補充制劑B的克隆培養(yǎng)基. F:克隆培養(yǎng)基改為添加了補充制劑B的單細胞克隆培養(yǎng)基??寺』謴?fù)值以第7-10天克隆生長孔的百分比表示。
 
  添加劑能夠保持分選后的培養(yǎng)板細胞在前7天不受干擾,顯著提高了克隆率。在7天后,我們獲得了更大尺寸和良好形態(tài)的克隆團(圖2)。最后,我們替換了克隆板中的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基,并使用優(yōu)化的培養(yǎng)基進行iPSCs的單細胞接種,優(yōu)化條件包括鹽溶液重懸樣品,加上適合目的的克隆培養(yǎng)基,并以優(yōu)化濃度的培養(yǎng)基補充物等,從而獲得高達80%的單克隆率(圖1 F)和長勢良好的克隆團(圖2)。
 
  (值得一提的是:此次實驗還測試了其他沒有顯著影響克隆恢復(fù)的參數(shù)。如,不同的ROCK抑制劑配方、板涂層和板類型。但不能認為這些變量在其他實驗條件下使用時不會對克隆恢復(fù)產(chǎn)生影響。)

圖2:克隆生長與形態(tài)

 
  使用UP.SIGHT分選單細胞到96孔板中,并在第7天進行板底成像。
 
  本實驗中對UP.SIGHT板成像能力也進行了測試。從圖中能夠確認圖像質(zhì)量足夠好,可以評估克隆的形態(tài),以確定細胞在單細胞分選后是否保持其典型的iPSCs形態(tài)(圖2)。

圖3:用UP.SIGHT進行克隆生長監(jiān)測

 
  此外,UP.SIGHT上的成像系統(tǒng)與傳統(tǒng)顯微鏡相比具有更快的優(yōu)勢:整個孔板(96/384孔板)的圖像采集不到6分鐘,大大減少了孔板在培養(yǎng)箱外的停留時間,尤其是384孔板。當(dāng)在全孔板上進行初始篩選時,這一點特別重要,可以在多個時間點快速進行成像(圖3)。
 
  結(jié)論  
 
  本研究表明,使用UP.SIGHT分選iPSCs可獲得良好形態(tài)的克隆團,具有較高的克隆恢復(fù)率。為了更大化克隆恢復(fù),可通過優(yōu)化關(guān)鍵參數(shù):細胞在分選前收獲時的活率和生長狀態(tài)、細胞懸液、克隆培養(yǎng)基及補充物,以確保細胞在分選后的第一天盡可能不受干擾;UP.SIGHT的快速平板成像功能可實現(xiàn)生長克隆的形態(tài)監(jiān)控和快速篩選。
 
  總之,UP.SIGHT是一種多用途儀器,可實現(xiàn)高效、高質(zhì)量和節(jié)省時間的iPSCs分選和早期監(jiān)測,以選擇正確優(yōu)質(zhì)的單克隆。
 
  參考文獻
 
  [1] Jarrige, M., Frank, E., Herardot, E., et al. (2021). The future of regenerative medicine: Cell therapy using pluripotent stem cells and acellular therapies based on extracellular vesicles. Cells 10, 1–29. 10.3390/cells10020240.
 
  [2] Chen, Y., Tristan, C.A., Chen, L., et al. (2021). A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods 18, 528–541.
 
  [3] Vallone, V.F., Telugu, N.S., Fischer, I., et al. (2020). Methods for Automated Single Cell Isolation and Sub- Cloning of Human Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol 55.
 
  [4] Krol, R.P., Yamashita, M., Tsukahara, M., et al. (2021). Single-cell cloning of human induced pluripotent stem cells automation and protocol optimization. In International Society for Stem Cell Research.
 
  [5] Craig-Mueller, N., Hammad, R., Elling, R., et al. (2020). Modeling MyD88 Deficiency In Vitro Provides New Insights in Its Function. Front Immunol 11, 3327.
 
  [6] Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., et al. (2014). Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521–based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols 2014 9:10 9, 2354– 2368.
 
  [7] Kuo, H.H., Gao, X., DeKeyser, J.M., et al. (2020). Negligible- Cost and Weekend-Free Chemically Defined Human iPSC Culture. Stem Cell Reports 14, 256–270.