這篇文竟是關(guān)于拉曼自動(dòng)化反饋控制多種補(bǔ)料成分以實(shí)現(xiàn)高接種密度增強(qiáng)型fed-batch平臺(tái)過(guò)程的研究論文。該研究旨在開(kāi)發(fā)控制策略，通過(guò)在線(xiàn)拉曼光譜法監(jiān)測(cè)和調(diào)整代謝物濃度，以實(shí)現(xiàn)高接種密度下的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的高產(chǎn)量和穩(wěn)定性。具體使用了增強(qiáng)型high inoculation density (HID)高接種密度培養(yǎng)fed-batch平臺(tái)過(guò)程來(lái)培養(yǎng)五個(gè)不同谷氨酰胺合成酶piggyBac®中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO克隆。通過(guò)在線(xiàn)拉曼光譜法連續(xù)監(jiān)測(cè)殘余glucose葡萄糖、phenylalanine苯丙氨酸和methionine 甲硫氨酸的濃度變化，開(kāi)發(fā)了partial least squares models偏最小二乘模型。通過(guò)持續(xù)監(jiān)測(cè)殘余代謝物濃度，自動(dòng)調(diào)整三種補(bǔ)充成分的補(bǔ)料速率，從而保持葡萄糖、苯丙氨酸和甲硫氨酸在期望的設(shè)定點(diǎn)上，并確保其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度在所有培養(yǎng)的克隆中保持在可接受的水平。

細(xì)胞系與培養(yǎng)

 

使用了Lonza HID平臺(tái)的 GS piggyBac® CHO clones細(xì)胞系，共有5個(gè)克隆體。采用了100*10⁵的初始接種密度，在1L或者5L的體積進(jìn)行培養(yǎng)。

模型建立

 

使用了SIMCA v16分別對(duì)glucose, phenylalanine and methionine進(jìn)行建模處理。首先是光譜區(qū)域的選擇，主要是基于了在純水中他們各自的特征光譜范圍。其次，通過(guò) first derivative, Savitzky-Golay smoothing and standard normalvariate normalization (SNV) 的方法對(duì)原始光譜進(jìn)行了預(yù)處理。建立的模型結(jié)果如Table 1所示。

參考已知的文獻(xiàn)并結(jié)合所建模型的R²以及root mean squared error of estimation and cross-validation (RMSEE/RMSECV) ，初步判斷模型可用。分對(duì)于glucose, phenylalanine, and methionine，如果RMSEPs 是 < 1 g/L, 100 mg/L and 100 mg/L，則判斷結(jié)果模型結(jié)果是可用的。

在線(xiàn)拉曼光譜的收集使用了來(lái)自于Endress +Hauser的RXN2 system系列，有著 785 nm的光源并內(nèi)置了Runtime 6.2的操作系統(tǒng)。探頭使用了220 mm和420mm（分別在1L和5L的培養(yǎng)體積）的BioOptic探頭。采用了5sx150 scan的曝光時(shí)間和曝光次數(shù)，總時(shí)長(zhǎng)大約是12.5min。對(duì)于glucose, phenylalanine和methionine在線(xiàn)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，首先通過(guò)OPC的方式傳輸?shù)?strong style=";padding: 0px;outline: 0px;max-width: 100%;box-sizing: border-box !important;overflow-wrap: break-word !important">Delta-V(Emerson)，再在Delta-V對(duì)三個(gè)參數(shù)分別建立基于PID算法和on–off的控制回路，在監(jiān)測(cè)值低于目標(biāo)值的時(shí)候，可以自動(dòng)添加SF1, SF2和 SF3。SF1, SF2, and SF3對(duì)別對(duì)應(yīng)了glucose, phenylalanine and methionine的補(bǔ)料。

離線(xiàn)的樣品是每日從HID的培養(yǎng)中取出送樣檢測(cè)。使用了來(lái)自于Nova Biomedical的Bioprofile FLEX2分化分析儀。對(duì)于氨基酸以及最后產(chǎn)物的分析分別使用了high-performanceliquid chromatography (HPLC)和Tridex Protein Analyzer (IdexHealth Sciences)

上訴三個(gè)圖分別為glucose, phenylalanine和methionine的自動(dòng)控制情況以及SF1, SF2, and SF3在5個(gè)clones分別的添加總量。glucose的平均RMSEP是0.49 g/L (limit < 1 g/L), phenylalanine的平均RMSEP是40.72 mg/L (limit 100 mg/L) ,methionine的平均RMSEP是42.01 mg/L (limit 100 mg/L)，都是在可以接受的標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)的，

除此之外，文章還對(duì)其他的組分進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，以探究在HID平臺(tái)的自動(dòng)回路控制培養(yǎng)模式對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響。具體對(duì)比了培養(yǎng)體系中的histidine組氨酸、leucine亮氨酸、threonine蘇氨酸和ryptophan色氨酸的變化，以評(píng)估拉曼自動(dòng)回路控制對(duì)殘留氨基酸濃度的影響。

可以看出，利用拉曼自動(dòng)回路控制的方式，通過(guò)動(dòng)態(tài)提供培養(yǎng)物所需的氨基酸，有助于降低克隆間代謝的差異性。

此外，為了進(jìn)一步驗(yàn)證拉曼自動(dòng)控制的HID培養(yǎng)的效果，研究人員通過(guò)Peak VCC、Harvest VCC、 Harvest viability、Harvest lactate、Harvest NH₄、Harvest product concentration六個(gè)維度來(lái)評(píng)估對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)量的實(shí)際影響?？梢钥闯?，在HID平臺(tái)上培養(yǎng)的所有克隆均獲得較高的Peak VCC(320.5±32.3×10⁵) cells/ mL)，且直到收獲當(dāng)天，大多數(shù)HID培養(yǎng)保持在以上200.0×10⁵ cells/mL(4/5clones)?？偟膩?lái)說(shuō)，除2 clone號(hào)外，在HID工藝上培養(yǎng)的所有克隆在收獲時(shí)都有很高的活力(2clone的收獲活力較低，是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)結(jié)束時(shí)無(wú)意添加了堿基，導(dǎo)致VCC下降)。除2 clone，收獲時(shí)培養(yǎng)存活率均大于85%。

在HID培養(yǎng)過(guò)程中使用的自動(dòng)培養(yǎng)策略的另一個(gè)好處是代謝副產(chǎn)物的低水平。乳酸和銨是代謝副產(chǎn)物，其積累與抑制細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)?？傮w而言，在HID工藝下培養(yǎng)的所有克隆的平均乳酸收獲濃度(0.8±0.5 g/L)和銨收獲濃度(0.07±0.02 g/L)均較低，這表明以該種控制策略培養(yǎng)，不僅對(duì)氨基酸副產(chǎn)物的積累影響很小，而且對(duì)其他常見(jiàn)抑制副產(chǎn)物的積累影響也很小。

最后，本研究使用的5個(gè)clone在HID培養(yǎng)過(guò)程中獲得了較高的收獲產(chǎn)物濃度(6.5±1.2 g/L)。相比之下，本研究中獲得的收獲產(chǎn)物濃度平均略高于之前所報(bào)道的(6.5±1.2 g/L)。也可以得出結(jié)論，在本研究中觀(guān)察到的較高的產(chǎn)品濃度，部分原因是由于提出的自動(dòng)化策略可以維持高接種密度培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求，從而實(shí)現(xiàn)所需要補(bǔ)料操作的自動(dòng)化，減少了危險(xiǎn)副產(chǎn)品的積累。

該研究通過(guò)應(yīng)用在線(xiàn)拉曼監(jiān)控技術(shù)和自動(dòng)化反饋控制策略，實(shí)現(xiàn)了高接種密度下的增強(qiáng)型細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的穩(wěn)定和高產(chǎn)量。這為生物制藥行業(yè)開(kāi)發(fā)更高效、成本更低的生產(chǎn)過(guò)程提供了新的思路和方法。